PCR: qué es y en qué consiste el PCR test o examen PCR del COVID19

La PCR es una prueba diagnóstica que se realiza en crisis de salud pública relacionadas con enfermedades infecciosas, así como en muchos otros casos o aplicaciones de laboratorio. En la pandemia de coronavirus, se está utilizando para determinar si una persona está infectada o no con el SARS-CoV-2. En este artículo, os explicamos en detalle qué es PCR, en qué se basa y qué es el examen o prueba pcr o PCR test, en general y en el caso del COVID19.

Qué es PCR. ¿Qué significa PCR?

El significado de las siglas PCR o PCR meaning, es Reacción en Cadena de la Polimerasa o Polymerase Chain Reaction (RCP), en inglés. La PCR es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, quien se llevó por ello un Premio Nóbel, y que consiste en amplificar un fragmento de ADN para obtener un gran número de copias de éste, para que así sea más fácil su identificación. Es uno de los avances científicos más importantes del siglo XX, al ser una manera rápida y sencilla de crear copias ilimitadas de ADN a partir de una sola hebra original. Con ella, se pueden crear millones de copias de una sección de ADN en tan solo unas horas.

Por tanto, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. La PCR sirve para identificar virus, bacterias, personas (cadáveres), test de paternidad, o hacer investigación científica de ADN, como la forense, la clonación, la filogenia, diagnóstico de trastornos hereditarios, etc.

En qué consiste un PCR test técnicamente

La PCR se fundamenta en la propiedad natural de las proteínas ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas, que permiten separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

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Para llevar a cabo una prueba PCR se necesita:

• Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

• Dos cebadores o iniciadores (en inglés primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, normalmente de dieciocho a veintidós nucleótidos, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

• Iones divalentes que actúan como cofactores de la polimerasa. Se suele usar magnesio (Mg²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn²⁺), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn²⁺ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN.

• Iones monovalentes, como el potasio.

• Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas, con temperatura óptima alrededor de 70°C. Puesto que las temperaturas del ciclo (95°C en las fases de desnaturalización del ADN), suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (Brock & Freeze, 1969) (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Erauso et al. 1993) (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). No obstante, se suelen emplear mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu y Vent).

• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

• Termociclador. Hoy en día, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante el termociclador, el aparato que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos, hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos, simplemente invirtiendo la corriente eléctrica; así como también tienen un sistema que calienta la tapa de cierre, con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.

Y a continuación, una vez dicho esto, explicamos qué es el examen pcr o prueba pcr en sí, es decir, cuál es su proceso o cómo se lleva a cabo.

La PCR en sí, consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos, donde cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas. Dichos pasos, a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado «hold») a alta temperatura (> 90°C), y seguido por otro hold al final del proceso, para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de gran variedad de parámetros, estos incluyen: la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Los pasos de cada ciclo de PCR son:

0. Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96°C (o 98°C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), durante 1-9 minutos. Esto solo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

1. Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas que lo constituyen). Este paso, puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95°C) de la muestra la forma más habitual. Otros métodos, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

2. Alineamiento o unión del cebador

A continuación, se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 40-68°C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

3. Extensión o elongación de la cadena

Consiste en la actuación de la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa, sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde, añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5’→ 3‘, uniendo el grupo 5′-fosfato de los dNTP con el grupo 3’-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). El tiempo de extensión, depende tanto de la ADN polimerasa usada, como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar; no obstante, hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

4. Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos, tras el último ciclo de PCR. Con ella, se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

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5. Conservación

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiempo indefinido, para conservar la reacción a corto plazo.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR, vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Tipos de PCR

A partir de la base anterior, se han desarrollado distintos tipos de PCR:

PCR anidada

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer, a su amplificación se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro de la amplificación inicial.

Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad, evitando posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica, es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR de extensión solapada (Mutagénesis)

Aquí se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5′ y un fragmento 3′ que se solapan, portando ambos la mutación. Se usan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa.

PCR in situ

Ésta consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. Se hace una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera, pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.

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PCR múltiple

Se trata de una PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes.

Ventajas: información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos.

Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) o PCR de transcripción inversa

Es una variante de la PCR en la que se usa ARN como molde inicial en vez de ADN y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

• 1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
• 2.º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
• 3.er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor T_m, del inglés melting temperature). Esta PCR, monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre.

Se puede llevar a cabo con técnicas basadas en fluorocromos no específicos o con técnicas basadas en sondas específicas, utilizando también un termociclador especial para PCR en tiempo real.

Otras variaciones de la PCR básica:

Además de los distintos tipos de PCR descritos, existen otras variantes de la PCR básica, los cuales solo os nombramos: PCR específica de alelo, PCR “assembly”, PCR asimétrica, PCR de colonia, Amplificación dependiente de helicasa, PCR hot-start, PCR específica de intersecuencia (ISSR), PCR inversa, PCR mediada por ligación, PCR específica de metilación (MSP), Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA), PCR cuantitativa, PCR-TAIL, PCR touchdown, PAN-AC, y PCR de ciclo térmico  rápido.

Cómo es la prueba PCR COVID19

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), es la prueba PCR de referencia para detectar la presencia del virus SARS-CoV-2. Mediante este test, se localiza y multiplica un fragmento de material genético del virus, que en este caso es ARN. Es una prueba muy específica que detecta concretamente el virus y lo distingue de otros que puedan ser parecidos.

Los análisis se realizan, generalmente, en laboratorios médicos automatizados y los resultados tardan varias horas. La RT-PCR del COVID19 será positiva cuando en el análisis se detecte material genético del virus. Si la prueba es negativa pero existe una alta sospecha, será necesario realizar otra prueba que permita detectar la presencia o no del virus.

Cabe indicar que la RT-PCR da positivo durante varias semanas después de la primera infección (30 días de media), ya que detecta la presencia del ARN del virus aunque éste ya no sea viable y el paciente haya superado la infección y ya no sea contagioso.

Por otro lado, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (rRT-PCR) en tiempo real, la prueba puede ser hecha en muestras respiratorias obtenidas por varios métodos, incluyendo el hisopo nasofaríngeo o la muestra de esputo. Los resultados están, generalmente, disponibles entre unas cuantas horas y 2 días.

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Si deseáis hacer un test PCR para el coronavirus porque tenéis varios síntomas de éste y sospecháis que podríais estar infectados, debéis poneros en contacto con sanidad o centros sanitarios, para que os ayuden y hagan la prueba PCR gratis en España, ya que en otros países es posible que tenga costes. Por el contrario, si no presentáis síntomas, pero queréis haceros igualmente esta prueba para estar tranquilos, en distintas clínicas ofrecen diferentes PCR precio, el cual puede ir desde los 30 hasta los 100 euros.

Otros test COVID19

Finalmente, a modo de apunte, decir que, desde el inicio de la pandemia, se ha realizado el diagnóstico de la enfermedad mediante técnicas de PCR; sin embargo, recientemente se han incorporado test rápidos, los cuales, como indica su nombre, son más rápidos y sencillos, permitiendo así saber en unos 10-15 minutos si una persona está infectada o no. Estos test, incluyen los métodos que detectan la presencia del propio virus y aquellos que detectan los anticuerpos producidos por el cuerpo humano en respuesta a la infección.

Entre los test moleculares, se encuentra la amplificación mediada por transcripción (ATM), en la que resultados pueden tardar menos de 3,5 horas.

La prueba de antígenos detecta el virus no por su ARN, sino por algunas proteínas de su cubierta. Es más rápida y barata que la PCR, pero menos fiable.

Mientras que las pruebas de serología, miden la presencia de los anticuerpos generados por el paciente después de la infección, los cuales persisten en el cuerpo entre pocas semanas y varios meses o quizás años. Son útiles para estudios epidemiológicos, pero no para saber si un paciente está infectado en ese momento.