La babosa de mar Elysia chlorotica (A. A. Gould, 1870), es capaz de mantener los cloroplastos del alga que come, Vaucheria litorea (Hofman ex. C. Agardh), durante meses y sobrevivir sin ingerir nada más, empleando la energía derivada de éstos al hacer la fotosíntesis. Hasta ahora, se desconocía como E. chlorotica mantiene vivos estos plastidios sin que reciban un aporte de proteínas (clorofila) y genético, por parte de las células del alga. En este estudio, se llevaron a cabo análisis genéticos, para demostrar si hay una relación más íntima y genética por parte de la babosa, cuando ingiere e incorpora dichos plastidios.
Presentación
“Active host response to algal symbionts in the sea slug Elysia chlorotica” (“Respuesta activa del hospedador a los simbiontes de algas en la babosa marina Elysia chlorotica”), es un artículo científico elaborado por Xin Chan, C., Vaysberg, P., Price, D. C., Pelletreau, K. N., Rumpho, M. E., y Bhattacharya, D., publicado en la revista “Molecular Biology and Evolution”, en abril de 2018, el cual trata de averiguar la relación íntima y genética que establece la babosa marina Elysia chlorotica con los cloroplastos simbiontes que ingiere y que mantiene vivos y funcionales en su cuerpo durante largos períodos de tiempo.
La babosa de mar Elysia chlorotica (A. A. Gould, 1870), es un nudibranquio de color verde y que se parece a una hoja de lechuga que habita por Nueva Inglaterra y Canadá y que se alimenta del alga Vaucheria litorea (Hofman ex. C. Agardh), extrayendo sus cloroplastos.
Además de esto, E. chlorotica es particularmente curioso ya que puede sobrevivir durante meses dependiendo solo de la energía de esos plastidios ingeridos del alga y que ha incorporado a sus células, los cuales siguen realizando la fotosíntesis activamente. Así, E. chlorotica, es el primer animal conocido que puede hacer la fotosíntesis.
El proceso de incorporación de los cloroplastos a su cuerpo es bastante sencillo. Primero, mediante succión, E. chlorotica ingiere los cloroplastos de algas Vaucheria litorea. Posteriormente, con un proceso de endosimbiosis, incorpora los plastidios dentro del citoplasma de las células que recubren sus divertículos digestivos, y los mantiene vivos ahí, como si estuvieran en las células del alga.
Además, la relación de dependencia que establece Elysia chlorotica con los cloroplastos del alga es tan íntima e importante, que estas babosas marinas no pueden completar la metamorfosis y convertirse en adultos en ausencia de estos plastidios en su interior. Los juveniles se alimentan del alga durante una semana aprox., y después de este tiempo, los plástidos solos pueden soportar el crecimiento continuo del animal.
Hasta ahora, se desconoce cómo este animal puede mantener los orgánulos activamente fotosintetizadores sin reponer las proteínas del núcleo celular perdido y los genes del alga; así como las conexiones metabólicas y la interdependencia de la babosa y los plástidos también son poco conocidas.
Sin embargo, se sabe que, con el secuestro de los plastos, Elysia chlorotica acumula gotas de lípidos derivadas de algas de ácido eicosapentaenoico 20: 5, entre otros, como una posible reserva metabólica. Además, la actividad de los plástidos es dinámica en el hospedador. La medición de la fluorescencia de clorofila, de forma paralela, en E. viridis, muestra la variabilidad temporal de los fotopigmentos, y se ha visto que los animales mantenidos en la oscuridad pierden tejidos, en comparación con las babosas marinas que crecen bajo niveles de luz bajos o normales. Esto, predice una relación más íntima entre el plastidio de algas y el invertebrado, que estaría respaldada por un patrón de expresión génica adaptado a las algas durante el desarrollo animal.
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Por ello, para averiguar esto, en este estudio, los autores mencionados antes, han utilizado el análisis genético del RNA-Seq, para probar la idea de que el secuestro de plástidos deja una firma significativa en la expresión del gen durante el desarrollo de E. chlorotica. Y para ello, analizaron los datos transcriptómicos de la fase aposimbiótica (APO) de la babosa (antes de la ingestión de plastidios, 1–2 días después de la metamorfosis), de la fase de secuestro de plastidos transitorios (5D), entre 1 y 5 días de alimentación, la fase del plastido de transición (7D), a los 5-7 días cuando se produce la transición a la cleptoplastia permanente, y la fase estable de los plástidos en el animal (10D), después de 10 días de alimentación.
Este trabajo, identificó 12.619 transcripciones como genes expresados diferencialmente (DEG), agrupados jerárquicamente en nueve supercúmulos (SC1-SC9) de APO, 5D, 7D y 10D. Tras esto, los resultados respaldan la hipótesis planteada antes y muestran que, tras la exposición e ingestión de plastidios de V. litorea, los genes implicados en los patrones moleculares asociados a los microbios y los mecanismos de respuesta al estrés oxidativo, están significativamente regulados. Además, curiosamente, estos resultados con E. chlorotica, son similares a los encontrados en los corales marinos que mantienen los dinoflagelados como células intactas, lo que sugiere paralelismos entre estas interacciones simbióticas entre animales y algas.
Métodos de análisis y trabajo
A continuación, se explican los métodos de análisis y de trabajo que siguieron los autores de este artículo para obtener los resultados esperados.
Cultivos de Elysia chlorotica y extracción de ARN
Se cultivaron animales juveniles de Elysia chlorotica (A. A. Gould, 1870) en el laboratorio. Los huevos apostóticos se obtuvieron de animales recolectados originalmente en pantanos ubicados en Martha’s Vineyard (EE.UU.). Dichos animales apostólicos (APO), fueron inducidos a metamorfosis usando V. litorea contenida dentro del tubo de diálisis. La cleptoplastia transitoria (5D), estuvo representada por animales alimentados con V. litorea después de la metamorfosis hasta 5 días, y la transición a la cleptoplastia permanente (7D), estuvo representada por animales alimentados con la misma alga entre 5 y 7 días. Se observó cleptoplastia permanente (10D), en animales alimentados durante más de 10 días. Cabe indicar que en caso de que se murieran de hambre, estos animales retendrían sus plástidos, al contrario que los de cleptoplastia transitoria.
Por otro lado, se usaron múltiples descendientes de la misma población adulta, para generar y recolectar suficiente muestra de tejido para permitir la extracción de ARN. Las cámaras de cría se revisaron diariamente durante un período de 3 meses, y los animales recolectados de las diferentes etapas, se congelaron. Una vez que se recolectó suficiente material biológico, se usaron tres réplicas técnicas de muestras de tejido animal agrupadas (> 25 animales individuales), para generar bibliotecas Illumina RNA-Seq, para cada etapa de desarrollo (APO, 5D, 7D, 10D).
Las muestras de tejido se lisaron y homogeneizaron en 1ml de Trizol. Las bibliotecas Illumina RNASeq, se prepararon usando el kit de preparación de muestras de ARN TruSeq (Illumina, Inc, San Diego, CA). Se empleó un transcriptoma de referencia para las lecturas, en el cual se buscaron las transcripciones en la base de datos de proteínas NCBI nr y, las que tuvieron éxito, se registraron. También se anotaron los dominios de proteínas, mientras que las vías metabólicas asociadas con las funciones anotadas de los genes, se identificaron usando KEGG Mapper.
Análisis genéticos
Las lecturas de secuencia para cada muestra se mapearon en el transcriptoma de referencia. El análisis de los DEG y la agrupación jerárquica posterior de los perfiles de expresión génica, se realizaron utilizando el paquete DESeq2 en Bioconductor. El valor de la expresión se calculó en función del número de fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas (FPKM). En este caso, un fragmento mapeado requiere que ambas lecturas en un par mapeen la transcripción. La diferencia entre dos valores de FPKM (cambio de pliegue) se evaluó mediante una escala log2. Usando este criterio, los autores identificaron 12,619 de las 130,413 transcripciones como DEG, al comparar cualquiera de las dos condiciones. Asimismo, los términos GO (Gene Ontology) mapeados en cada SC, se compararon con todos los términos GO mapeados en las 24.097 transcripciones con éxitos. También se aplicaron análisis estadísticos.
Los genes SC5 no mostraron cambios en la expresión de APO a 7D, sino un aumento en 10D. Sus funciones abarcan todas las categorías KEGG, con una pequeña proporción relacionada con el procesamiento de información genética. Los términos GO enriquecidos en el subgrupo analizado SC5, incluyen microtúbulos, actividad NAD + ADP-ribosiltransferasa y polimerización de proteínas. En concreto, en SC5 se encuentran genes que codifican tubulinas alfa y beta y proteínas asociadas a microtúbulos. Las estructuras microtubulares de tubulina facilitan la absorción de partículas de alimentos o células extrañas durante la fagocitosis. Estas funciones son, probablemente, complementos críticos en el mantenimiento de la simbiosis entre los plástidos y la babosa Elysia chlorotica.
Resultados de los análisis genéticos de Elysia chlorotica
A continuación, se narran los resultados obtenidos por los autores del estudio, tras el análisis genético, divididos en los siguientes apartados:
Funciones reguladas por exposición a V. litorea
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Tras los análisis, los científicos hallaron 384 genes en el subgrupo SC1 y 161 genes en SC9, que exhibían regulación ascendente desde las etapas APO a 5D. La expresión de los genes SC1 se reguló de manera descendente desde las etapas 5D y 7D, hasta su aumento de nuevo en 10D; mientras que los genes de SC9, se regularon descendientemente hasta el final desde 5D, acercándose al nivel de APO en 10D. Todo esto puede verse representado en las gráficas de la figura inferior.
Las funciones codificadas por estos genes en Elysia chlorotica, están en las categorías KEGG de biosíntesis y metabolismo de glucano y transporte de membrana; y dentro de los términos GO, de transporte transmembrana, glucosilación de proteínas, procesos metabólicos de glucosa, regulación de la migración celular, actividad de hidrolasa, de oxidorreductasa y proceso de oxidación-reducción.
Cabe indicar que los glucanos también están presentes en otros seres vivos que realizan simbiosis con microbios o bacterias, de modo que son capaces de iniciar una cascada de señalización en respuestas del hospedador. En el caso de E. chlorotica, el metabolismo y el transporte de los glucanos y sus derivados, son críticos durante esta exposición temprana (APO, 5D) y en la maduración posterior de la simbiosis (10D), pero no durante la estabilización de los plástidos (7D). Por tanto, a la vista de estos resultados, los autores sugieren la existencia de un mecanismo de señalización MAM-PRP en E. chlorotica tras su exposición al alga V. litorea, así como también sugieren un posible mecanismo oxidativo de respuesta al estrés en la babosa marina.
Funciones mejoradas durante el establecimiento de la simbiosis
Los genes en SC2, están regulados durante la etapa inicial de simbiosis (de APO, 5D) y durante la transición a la cleptoplastia permanente (7D), antes de una disminución en 10D, que se aproxima al nivel de APO. Las funciones de estos genes son probablemente críticas para E. chlorotica cuando se establece la simbiosis con V. litorea y menos en su mantenimiento posterior. Además, la expresión de 168 genes en SC8, se incrementó durante el establecimiento de simbiosis entre las etapas 5D y 7D.
Como se muestra en la siguiente figura, las vías KEGG más prevalentes codificadas por los genes SC2, están relacionadas con el procesamiento de información genética; es decir, transcripción, replicación y reparación, plegamiento, clasificación y degradación, y traducción. Entre los genes con funciones relevantes para la transcripción, los genes SC2 codifican 81 proteínas ribosómicas y 84 proteínas involucradas en el transporte de ARN. También se observa una prevalencia entre todas las funciones metabólicas. Más del 25% de los genes en cada categoría, excepto la biosíntesis de otros metabolitos secundarios, se encuentran en SC2, incluido el metabolismo de terpenoides y policétidos, el metabolismo energético, y el metabolismo de nucleótidos. Asimismo, la biosíntesis de antibióticos es la función más representada entre los genes SC2, al igual que la fosforilación oxidativa y la glucólisis.
Por su parte, los términos GO enriquecidos en SC2 incluyen: regulación de iniciación de replicación de ADN dependiente de ADN, reparación de escisión de base, y complejo de factor de iniciación de traducción eucariótica.
Estos resultados, indican una mayor capacidad en el metabolismo, el procesamiento del ADN, incluida la reparación del ADN, y la fosforilación, que refleja la respuesta del hospedador tras la exposición a V. litorea, y que abarca mecanismos moleculares relevantes para la respuesta de estrés inicial y para establecer la simbiosis. La disminución de la expresión génica tras la maduración de la simbiosis, concuerda con la observación de la fotoautotrofia en E. chlorotica, lo que sugiere que las funciones citadas antes, son compensadas por el plastidio del alga.
Funciones reguladas en descenso durante el desarrollo de la simbiosis
La expresión de 5.215 genes se reguló negativamente durante el establecimiento temprano, pero no al madurar la simbiosis. Estos genes, representan el 41.3% de todos los DEG y muestran una disminución continua en la expresión hasta siete días después de la introducción de V. litorea, antes de que su expresión aumente de 7D a 10D. Además, la expresión de 74 genes adicionales, sigue un patrón similar, aunque la regulación a la baja de la expresión génica ocurre más tarde, de 5D a 7D, durante el establecimiento de la simbiosis.
Asimismo, la expresión de los genes SC3 y SC6 después de que se estableció la simbiosis (10D), volvió al nivel que se aproxima a la etapa aposimbiótica (APO). Las funciones predominantes codificadas por estos genes, están relacionadas con el procesamiento de información ambiental, es decir, las moléculas de señalización y la interacción, transducción de señal y transporte de membrana, procesos celulares, como por ejemplo comunidad celular–eucariota, y aquellos relacionados con sistemas organismales, como adaptación ambiental, sistema circulatorio, sistema nervioso, desarrollo y sistema sensorial.
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Por otro lado, al comparar los términos GO anotados en SC3 con todos los términos GO anotados en el conjunto de datos, los términos sobrerrepresentados incluyen regulación de la transducción de señal de proteína Rho, desfosforilación de proteínas, transporte de cloruro, y transporte transmembrana de iones de calcio, así como complejo de canales de cloruro y complejo de canales de calcio dependientes de voltaje. Este hallazgo, indica que E. chlorotica, en presencia de V. litorea y durante el establecimiento de la simbiosis, sufre una detención en algunas señales moleculares y transporte, movimiento y funciones neuronales y sensoriales (5D y 7D). Estas funciones, se regulan posteriormente de que se establezca la simbiosis (10D), lo que indica su importancia en el mantenimiento y la maduración de la interacción.
Funciones reguladas en descenso en toda la simbiosis
La expresión de 2.343 genes SC4, se reguló también negativamente en la primera introducción de V. litorea (de APO a 5D), y permaneció baja en 7D y 10D, después de la exposición a los plastidios. Por su parte, la expresión de 281 genes SC7, mostró también un patrón similar, con regulación descendente entre 5D y 7D después de la exposición a plastidios.
De estos genes, las vías de KEGG prevalentes son la biosíntesis de otros metabolitos secundarios, moléculas de señalización e interacción y traducción; así como otras funciones incluyen el sistema digestivo, el sistema sensorial, el desarrollo y la motilidad celular; mientras que pocos genes codifican funciones relacionadas con la transcripción y la replicación y reparación.
Los términos GO enriquecidos en SC4, incluyen alargamiento de la traducción, regulación negativa de la fagocitosis, respuesta al estrés salino, respuesta a la privación de agua, así como citosólico, subunidad ribosómica, y constituyente estructural del ribosoma.
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Estos hallazgos sugieren que es probable que funciones tan amplias, en particular genes que codifican funciones de señalización y ribosomas, se supriman continuamente tan pronto como se introduce V. litorea, hasta la maduración de la simbiosis. El alga puede compensar algunas de estas funciones, particularmente la función crítica de las proteínas ribosómicas en la traducción. Por el contrario, la supresión de la función fagocítica, puede reflejar la disminución de la dependencia de E. chlorotica de la fagocitosis. Además, este punto de tiempo, corresponde con la acumulación de lípidos observados en E. chlorotica, mientras se establece la simbiosis. Por lo que los autores consideran que la supresión de los genes relacionados con la fagocitosis, puede facilitar la acumulación de plastidios y sus lípidos en las células animales.
Conclusión del estudio sobre las respuestas de Elysia chlorotica a su alga simbionte
A pesar de no codificar ningún gen de Vaucheria litorea en su genoma nuclear, la babosa de mar Elysia chlorotica, ha desarrollado un conjunto de mecanismos moleculares para responder, hacer frente y mantener su simbiosis con los plástidos robados del alga dentro de un entorno de alta energía.
Cuando se expone por primera vez a V. litorea, E. chlorotica responde aumentando temporalmente su capacidad en la cascada de señalización MAMP-PPR en relación con el reconocimiento de células extrañas, el metabolismo de varios metabolitos y el procesamiento de información genética, mientras suprime los procesos de otras señales moleculares, comunicaciones y actividad neuronal. Esta respuesta, puede atribuirse a una respuesta de estrés inicial del animal y progresa a lo largo del establecimiento de la simbiosis. Estas tendencias, vuelven en la maduración de la simbiosis. Asimismo, el marcado aumento en la capacidad de señalización molecular y actividad neuronal tras la maduración de la simbiosis, y la supresión permanente del fagosoma y el ribosoma, pueden indicar la participación de la comunicación e interacción celular, y la complementariedad de las funciones genéticas entre la babosa y los plástidos del alga.
Finalmente, los autores indican que es notable que tanto la formación de simbiosomas de corales como la cleptoplastia de algas en E. chlorotica, sigan un patrón similar y ofrezcan información complementaria sobre cómo la simbiosis impacta la expresión del gen del hospedador. Por lo que, sus hallazgos respaldan aún más la hipótesis de que el plastidio no es simplemente un alimento almacenado para más tarde, como sugieren algunos, sino más bien, una fuente de energía que apoya e integra al desarrollo animal.
Fuente de este artículo
Este artículo fue publicado originalmente en la revista “Molecular Biology and Evolution”, bajo la referencia: Xin Chan, C., Vaysberg, P., Price, D. C., Pelletreau, K. N., Rumpho, M. E., Bhattacharya, D. (2018) “Active host response to algal symbionts in the sea slug Elysia chlorotica”, Molecular Biology and Evolution, Volume 35, Issue 7, July 2018, Pages 1706–1711, https://doi.org/10.1093/molbev/msy061; el cual está disponible con acceso libre en la web de Oxford Academic.
